Abengoa生物能源新技术公司总部位于西班牙塞维利亚，是一家用创新解决方案进行生物燃料生产的国际公司。该公司正在寻求建立一个筛选过程并使之自动化，以确定产纤维素酶真菌突变菌株中的纤维素酶活性。
由于人工筛选过程成本高、耗时长，因此自动化是此类大型项目的先决条件。Abengoa分别与 Biomar微生物技术公司和 Mejoran实验室自动化公司建立了密切的合作关系，以打造理想的解决方案。Biomar位于西班牙莱昂，是微生物应用研究的先驱，为医疗保健、农业和可再生能源等领域提供可持续的解决方案，因此在微生物菌种的生成、筛选和生物活性分析方面拥有坚实的背景。Mejoran公司总部位于西班牙马德里，是一家实验室自动化解决方案提供商。
筛选过程的第一步是选择不同真菌突变体的克隆，并将其转移到96孔板中，以产生微接种体，用于进一步发酵。第二步是在96孔板中培养发酵不同的突变体。最后，对不同突变体产生纤维素酶的能力进行评估。
事实证明，Freedom EVO 150工作站整合Pickolo克隆挑选模块是进行真菌克隆挑选和随后不同培养条件筛选的理想解决方案。Freedom EVO工作站可以根据用户的标准轻松识别、选择和挑取真菌克隆。此外，Freedom EVOware®和Pickolo软件还可以定义独特的挑选程序，使微接种体的生长率达到100%，用于后续实验。具体方法是从真菌克隆的周边而不是从中心进行挑选，这种扫动挑选方式优化了吸头挑取的生物量，从而提高了生长率。
Freedom EVO 150工作站（图1）位于生物安全柜中，以确保无菌条件。它配备了一个使用一次性吸头的八通道移液机械臂（LiHa）、一个移板机械臂（RoMa）、一台Multidrop®Combi nL（Thermo Scientific）和一个Pickolo克隆挑选模块，该模块由Pickolo软件、安装在LiHa上的摄像头和工作台上的背光支架组成，用于克隆挑选。
图1 带Pickolo克隆挑选模块的Freedom EVO工作站
Pickolo克隆挑选模块硬件由安装在LiHa（2）上的摄像头（1）和工作台上的背光支架（3）组成。培养皿由RoMa（4）搬运。
将不同的产纤维素酶真菌突变体置于 90mm培养皿中，在37 °C、含添加剂的1%葡萄糖琼脂（Gibco）上培养8至48小时。从培养皿中挑取克隆并转移到96孔微孔板中，以获得微接种体，用于进一步的下游分析。图2显示了选择、挑选和接种真菌克隆的自动化工作流程概览。
克隆挑选的标准在 Pickolo软件中定义，该软件集成在Freedom EVOware®上，可在Freedom EVO 平台上执行挑选流程。
真菌的外观与传统的细菌菌落大不相同，它们会发育成直径大于1cm的深色菌落。本项目研究的菌株表现出典型的丝状真菌菌丝生长。因此，需要一个定制的挑选程序。
Pickolo软件提供了大量不同的标准来确定合适的挑选菌落。与其他挑克隆设备不同，该系统具有独特的功能，可以从较大菌落的周边而不是从中心进行扫动式挑取。这一点非常重要，因为菌落中心通常由开始坏死的老细胞组成。新细胞位于菌落外围，挑取后更有可能存活。图3显示了从真菌菌落边缘挑取克隆的过程。
图3 使用Pickolo软件拍摄的照片显示了木质素分解真菌克隆，在克隆挑选步骤后留下的划痕（红色箭头）。
收集足够的真菌生物量，
确保100%的转移生长率，以便进行后续分析
产纤维素酶的真菌菌株是真菌细胞的部分菌丝长入琼脂2-3mm的微生物。为了制备进一步分析的材料，必须收集琼脂内部和表面的所有生物材料，以获得足够的、可存活的接种体，用于所选菌落的进一步生长和扩增。
我们在Freedom EVO工作站上开发了一种定制方法，将吸头插入琼脂的动作与侧向移动的动作相结合，模仿人工挑选克隆的典型扫动动作，同时吸出生物质。使用针或针头的克隆挑选设备无法实现这种完全吸取生物材料的操作。下图4展示了这一过程。
使用这种方法可获得直径为60-100μm的微接种体，生长率为100%。所有挑取的克隆都在96孔微孔板中培养成微接种体（图5），这种培养方式非常适合进一步的下游测试。由于挑取的所有克隆都能存活，这种方法的产量也比人工方法高。
这个宏大的纤维素酶生产真菌高通量克隆筛选 (HTS) 项目展示了 Freedom EVO克隆挑选工作站的高容量和独特功能。与典型的细菌菌落相比，真菌的挑选更为复杂，需要先进的选择标准、复杂的移液和模拟人工挑选过程的吸头移动相结合。
利用这些特点，可以识别和挑选大型真菌克隆。成功地从菌落一侧挑取足够多的可存活生物材料后，就能为后续研究创造出具有100%生长率的微接种体。
这里展示的自动化解决方案为Abengoa提供了在预期时间内执行其宏大的HTS计划所需的可重复性和有效性。
数据由Abengoa生物能源公司、Biomar微生物技术公司的Angeles Vinuesa和Mejoran实验室自动化公司的Francisco Arenal慷慨提供。
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